RNAlong RNA 長期保存液

保存條件：4℃。
產(chǎn)品介紹：
RNA性質(zhì)不穩(wěn)定，極易降解。溶解于無RNase的TE 或水中的純化RNA，即便是儲(chǔ)存于-20 oC也難免降解。為解決這一問題，可以將RNA沉淀或RNA溶液溶解于RNA 長期保存液中，允許RNA 4oC保存或-20oC至少保存1年而免于降解。RNA長期保存液是RNA樣品運(yùn)輸和中長期保存的佳選擇。需要時(shí)可用常規(guī)乙醇法沉淀回收RNA，或直接吸取儲(chǔ)存于RNA 溶解保護(hù)液中的高濃度RNA(可達(dá)4 mg/ml)進(jìn)行RNA 電泳、Northern Blot。
注意事項(xiàng)：
1. RNA 長期保存液可能抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性，做 RT-PCR 反應(yīng)前應(yīng)該用乙醇沉淀 RNA。
2. 在 RNA 長期保存液中的 RNA 的終濃度不應(yīng)該超過 4μg /μl。用 RNA 長期保存液溶解 RNA 沉淀：
1. 對固體 RNA 沉淀，每 0.4-4μg RNA 沉淀加入 1μl RNA 長期保存液，反復(fù)吹打混勻或者室溫振蕩 15-30 min 溶解沉淀。干燥的 RNA 沉淀難以溶解，可反復(fù)吹打混勻后 50oC 加熱 10-15 min。先用小體積無 RNase 的TE 或水溶解 RNA 沉淀，然后按液態(tài) RNA 操作。
2. 對液態(tài) RNA 溶液，每 0.4-4μg RNA 溶液加入 1μl RNA 長期保存液，混勻。注意混合液中 RNA 長期保存液的體積百分比不低于 80%。
3. 測定 OD 值。注意加入相應(yīng)量的 RNA 長期保存液做空白。
4. 將溶解的 RNA 樣品儲(chǔ)存于-20 oC 或者-70 oC。從 RNA 長期保存液中沉淀 RNA：
1. 估計(jì) RNA 溶液終體積。加入 4 倍體積的無水乙醇，混勻。如果溶液體積過小，可加入 RNase free water 稀釋 RNA 溶液,如果溶液中 RNA 含量低于 0.25μg /μl，可加入 5M NaCl(RNase free) 至終濃度 0.2M,混勻后再加入 4 倍體積乙醇。
2. 室溫放置 5 min。
3. 12,000rpm 離心 5 min,棄上清,風(fēng)干，溶解。
4. 重新沉淀的 RNA 溶解后可用于 RT-PCR 反應(yīng)。也可用于任何其他實(shí)驗(yàn)。直接使用 RNA 長期保存液中的 RNA：直接吸取 RNA 長期保存液中的 RNA，進(jìn)行普通或甲醛變性電泳和 Northern Blot。進(jìn)行甲醛變性電泳時(shí)，最后上樣的樣品中的 RNA 長期保存液的濃度可高達(dá) 50%。
附：甲醛變性電泳樣品準(zhǔn)備： 臨用前，混合水（87μl），甲醛（81μl），50%甘油/含 0.25 mg/ml 溴芬蘭(48μl ) 和20X MOPS (24μl). 將上述混合液和 RNA 長期保存液中的 RNA 樣品等體積混合，55 oC 溫育 10 min，按照標(biāo)準(zhǔn)的甲醛變性電泳過程上樣。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。