【產(chǎn)品文獻(xiàn)支持】
影響因子(IF)=5.1：Lentivirus expressing soluble ST2 alleviates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice；寧波大學(xué)《International Immunopharmacology》
小鼠羥脯氨酸(Hyp)ELISA試劑盒
實(shí)驗(yàn)原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被小鼠羥脯氨酸（Hyp）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠羥脯氨酸（Hyp）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。
小鼠羥脯氨酸(Hyp)ELISA試劑盒樣本處理及要求
1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
標(biāo)本處理
1. 本公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
2. 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過高，應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行稀釋，使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。標(biāo)本使用0.01mol/L的PBS稀釋(PH=7.0-7.2)。
3. 若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性，并注意留存樣本。
4. 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。
5. 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測不出的情況。
6. 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。
7. 建議使用新鮮樣本，保存時(shí)間過長可能會(huì)存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。
需要而未提供的試劑和器材
1.酶標(biāo)儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標(biāo)板8孔×12條8孔×6條無
標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6管0.3mL*6管無
樣本稀釋液6mL3mL無
檢測抗體-HRP10mL5mL無
20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進(jìn)行稀釋
底物A6mL3mL無
底物B6mL3mL無
終止液6mL3mL無
封板膜2張2張無
說明書1份1份無
自封袋1個(gè)1個(gè)無
備注：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：8、4、2、1、0.5、0 μg/mL
2. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn)，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過zui大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1.嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
5.避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
6.在儲存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
9.不能使用過期產(chǎn)品。
10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準(zhǔn)備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3. 樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。
試劑盒性能
1. 檢測范圍：0.25 μg/mL – 8 μg/mL。
2. 靈敏度：檢測濃度小于0.1 μg/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。
說明
1. 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
2. 終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
3. 不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。
4. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說明才會(huì)得到的檢測結(jié)果。
問題解答
若實(shí)驗(yàn)效果不好，請及時(shí)對顯色結(jié)果拍照，保留所用板條及未使用試劑，并妥善保存，然后聯(lián)xi我公司為您解決問題。同時(shí)您也可以參考以下資料：
問題可能原因解決方案
標(biāo)準(zhǔn)曲線差吸取及洗滌不充分充分的吸取及洗滌
移液不精確檢查和校正移液器
精密度低洗滌不充分按說明書要求充分洗滌和浸泡
混勻不充分和吸取試劑不足充分混勻和吸取試劑
重復(fù)利用吸頭、容器和覆膜使用加樣器要更換新的吸頭、使用新的容器和覆膜
加樣不精確檢查和校正移液器
O.D值低每孔加的試劑量不精確校正移液器，精確加入試劑
溫育時(shí)間不正確保證充足的溫育時(shí)間
溫育溫度不正確試劑要平衡至室溫并保證準(zhǔn)確的溫育溫度
酶標(biāo)記物或底物失效通過混合酶標(biāo)記物和底物，顏色應(yīng)迅速顯現(xiàn)來檢查
沒有加入終止液按照說明書實(shí)驗(yàn)操作步驟加入終止液
超出讀數(shù)時(shí)間讀數(shù)在說明書推薦的讀數(shù)時(shí)間內(nèi)讀數(shù)
樣本值不正確的樣本儲存方式正確儲存樣本，使用新鮮樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
不正確的樣本收集和處理方法采取正確的樣本收集和處理方法
待測物質(zhì)在樣本中含量低使用新鮮樣本，重復(fù)實(shí)驗(yàn)
