智能化原子熒光光度計(jì)紫外可見吸收光譜法是根據(jù)溶液中物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外和可見光譜區(qū)輻射能的吸收來(lái)研究物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)的方法,而熒光分析法是由于處于一激發(fā)單重態(tài)低能級(jí)的分子以輻射躍遷的形成返回基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)產(chǎn)生的熒光的分析方法,兩者的區(qū)別在于前者研究的是吸收光譜,且電子躍遷為激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)到基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。
智能化原子熒光光度計(jì)
光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測(cè)試時(shí),離子濃度太高,也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。
樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)混合液不能存在氣泡,空白液無(wú)懸浮物,否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度,光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評(píng)估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,*等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。