河南專業(yè)科研細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)石蠟切片/冰凍切片實(shí)驗(yàn)-效勝實(shí)業(yè)

效勝實(shí)業(yè)河南專業(yè)科研細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)石蠟切片/冰凍切片實(shí)驗(yàn)
本公司開(kāi)展了石蠟包埋、石蠟切片、冰凍切片、HE染色，massson染色，PAS染色等染色，免疫組化，免疫熒光，WB .PCR.透射電鏡，掃描電鏡，細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)服務(wù)服務(wù)介紹
1)技術(shù)原理:
石蠟切片（paraffin section）是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中為廣泛應(yīng)用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中?；畹募?xì)胞或組織多為無(wú)色透明，各種組織間和細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區(qū)別出；組織離開(kāi)機(jī)體后很快就會(huì)死亡和產(chǎn)生組織，失去原有正常結(jié)構(gòu)，因此，組織要經(jīng)固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細(xì)胞組織死亡，而能清晰辨認(rèn)其形態(tài)結(jié)構(gòu)。
冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片。它實(shí)際上是以水為包埋劑，將組織進(jìn)行冰凍至堅(jiān)硬后切片的。在冰凍切片前組織不經(jīng)過(guò)任何化學(xué)藥品處理或加熱過(guò)程，大大縮短了制片時(shí)間。同時(shí)，由于此法不需要經(jīng)過(guò)脫水、透明和浸蠟等步驟，因而較適合于脂肪、神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片，并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床診斷

2）特點(diǎn)：
石蠟切片標(biāo)本可以*保存使用，為*性顯微玻片標(biāo)本。
冰凍切片制作過(guò)程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便，而多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷．組織變化不大,能很好保存脂肪，類脂等成分。能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對(duì)于那些對(duì)有機(jī)溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶保存較好。
石蠟切片

（一）石蠟切片前的準(zhǔn)備
1．切片刀。傳統(tǒng)的切片刀在使用之前，一定要在顯微鏡下檢查刀口的損傷程度，然后進(jìn)行磨刀?，F(xiàn)在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。
2．修整蠟塊：切去組織周圍過(guò)多的石蠟，一般情況下在組織周圍留有約1~2mm的石蠟邊，兩邊必須平行。
3．蠟塊固定：修整好的蠟塊先固定在事先準(zhǔn)備好的小方木塊或者金屬塊上，固定方法是把蠟鏟先在酒精燈上加熱，再將蠟塊底部烙熔，迅速烙粘在小方木塊或金屬塊底座上。
4．載玻片擦洗干凈后，在其表面涂上粘附劑（蛋白甘油、APES或多聚賴氨酸），根據(jù)染色方法選擇不同的粘附劑。
5．準(zhǔn)備好毛筆、鑷子、染色架。
6．調(diào)好展片器內(nèi)水的溫度（45℃），有時(shí)也可以加些酒精到水中。
（二）石蠟切片
1．將切片刀裝在刀片機(jī)的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。
2．切片多使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，切片時(shí)，左手執(zhí)毛筆，右手轉(zhuǎn)切片機(jī)轉(zhuǎn)輪，先修出組織塊。
3．調(diào)整切片機(jī)上的切片厚度為4~7μm，然后切片。
4．切片可以是單張，也可以是連續(xù)切片形成蠟帶
5．展片和撈片：
（1）直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待*展平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時(shí)擺正切片。
（2）溫水漂浮法：此法用展片機(jī)或者用恒溫水浴箱，先使水溫保持在45~50℃，用左手拿毛筆輕輕托起切片，用右手用*子夾起切片的一角，正面向上輕輕平鋪放置于展片器的水面上，動(dòng)作要輕快，切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會(huì)自然平整地展開(kāi)，必要時(shí)可用*輕輕拔開(kāi)，然后撈片，并及時(shí)編號(hào)。
6．展好的切片在室溫下稍微干燥后，放在40℃恒溫烤箱中，小片組織30分鐘即可，大的需12~24小時(shí)，烤干備用。
（三）注意事項(xiàng)
1．切片刀刃傾斜過(guò)大或過(guò)小都不能正常進(jìn)行切片。
2．修整蠟塊時(shí)要細(xì)心，看清楚組織在蠟塊中的位置，以免將需要的組織修掉。
3．連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)的轉(zhuǎn)輪時(shí)，速度一定要均勻，不能時(shí)快時(shí)慢，以免切片厚薄不一。
4．使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片時(shí)，是由下向上切，為得到定然整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬、脆難切的部分放在上端，如皮膚應(yīng)將表皮部分向上，腸胃等組織應(yīng)將漿膜面面朝上。
5．用展片器展片時(shí)，水溫應(yīng)根據(jù)使用的石蠟熔點(diǎn)進(jìn)行了調(diào)整，一般低于石蠟熔點(diǎn)10~15℃；撈片的時(shí)候動(dòng)作要輕、稍快。動(dòng)作太大容易出現(xiàn)氣泡。如果沒(méi)有展片器可以用溫水浴鍋來(lái)代替。
6．單個(gè)切片要擺到載玻片的1/3與2/3交界處；連續(xù)切片的粘片順序一般是從左到右，組織切片較小是，可以并列粘貼2~3條蠟帶。
7．烤片的溫度不宜過(guò)高；烤片的時(shí)間要合適。腦組織要待稍微晾干一些后，才能烤片，否則容易產(chǎn)生氣泡影響染色和觀察。

冰凍切片

冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片。它實(shí)際上是以水為包埋劑，將組織進(jìn)行冰凍至堅(jiān)硬后切片的。在冰凍切片前組織不經(jīng)過(guò)任何化學(xué)藥品處理或加熱過(guò)程，大大縮短了制片時(shí)間。同時(shí)，由于此法不需要經(jīng)過(guò)脫水、透明和浸蠟等步驟，因而較適合于脂肪、神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片，并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床診斷。
1. 取材：  應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。
2. 速凍：  為了較好地保存細(xì)胞內(nèi)的酶活性或盡快制成切片標(biāo)本的需   要，一般在取材后就要立刻對(duì)組織塊進(jìn)行速凍，使組織溫度驟降，縮短降溫的時(shí)間，減少冰晶的形成。  液氮速凍切片法是實(shí)驗(yàn)室常用的速凍切片方法。具體做法是將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。若需要保存，應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?br />3．固定：  樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4℃冰箱預(yù)冷5-10min讓OCT膠浸透組織。  取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。  組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，以*覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。
切片：  恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi)，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5-10μm。切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～-20℃為宜，溫度過(guò)低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。切好室溫放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。進(jìn)行抗原熱修復(fù)，微波熱修復(fù)也可，室溫自然冷卻?？捎?%H2O2孵育5~10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。
5．免疫熒光染色：
冰凍切片室溫晾干15min,可用含10％正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1 小時(shí)（此步可不洗）
滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液(抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個(gè)過(guò)程中不會(huì)使組織干涸)，將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜。
第二天先將濕盒放到37℃回溫1h，然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。
滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37℃孵育1 小時(shí)。  回收二抗，切片置于染缸內(nèi)，PBS洗5min×3次。
滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min(工作濃度0.1%染色15min)。
回收DAPI,滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹(shù)膠，用處理干凈的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。做好的片放在切片盒內(nèi)，置于4℃冰箱，可保存一周左右。