Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2g/ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個核細(xì)胞。
工具/原料
全血 （以10ml為例）
無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培養(yǎng)基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
雙抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亞砜（DMSO）（SIGMA）
預(yù)先裝好異丙醇的凍存盒
方法/步驟
配制所需的溶液：
a. 細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 細(xì)胞凍存液：FBS中加入10%DMSO；
將10ml全血轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入10ml PBS溶液稀釋，輕輕混勻；
取兩支15ml離心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的ficoll上層，一定要輕柔，避免兩種溶液混合在一起，每只離心管各10ml稀釋血液；
2,000rpm，20min，注意，降速設(shè)置中一定要設(shè)置成no break，或者只有1-2成的制動。離心完畢將得到如圖所示分層；
人外周血單核細(xì)胞（PBMC）分離及培養(yǎng)
PBMC所在細(xì)胞層為白色。此時可以用吸管將該層細(xì)胞吸取在另一干凈的15ml離心管中。
加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min離心后去掉上清，再加入培養(yǎng)基進(jìn)行相同操作的清洗；
7
加入5-10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)計數(shù)培養(yǎng)或者鋪板；
8
細(xì)胞凍存：將細(xì)胞離心收集之后，用細(xì)胞凍存液重懸。取1-1.5ml細(xì)胞至凍存管中，放入凍存盒（凍存盒可事先在4℃冰箱預(yù)冷）。再將凍存盒放置于-80℃冰箱過夜。第二天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中保存。
END
注意事項
全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層，但是終都必須保證兩種溶液分層清晰。
分離PBMC*步離心的時候，一定不能設(shè)置或設(shè)置低水平的制動。否則將分層混亂。
