基本概念編輯
流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry,FCM）是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計(jì)算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物。
基本結(jié)構(gòu)
流式細(xì)胞儀由三部分構(gòu)成
1.液流系統(tǒng)，包括流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；
2.光學(xué)系統(tǒng)，包括激發(fā)光源和光束收集系統(tǒng)；
3.電子系統(tǒng)，包括光電轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。流式細(xì)胞儀的工作原理是使懸浮在液體中分散的經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞或微粒逐個(gè)通過樣品池，同時(shí)由熒光探測器捕獲熒光信號(hào)并轉(zhuǎn)換成分別代表前向散射角、側(cè)向散射角和不同熒光強(qiáng)度的電脈沖信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理形成相應(yīng)的點(diǎn)圖，直方圖和加三維結(jié)構(gòu)圖像進(jìn)行分析。
用于FCM的樣本是單細(xì)胞懸液，可以是血液、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液、各種體液、新鮮實(shí)體瘤的單細(xì)胞懸液以及石蠟包埋組織的單細(xì)胞懸液等。
基本原則
1.使各種液體和懸浮細(xì)胞樣本新鮮，盡快完成樣本制備和檢測；2.針對(duì)不同的細(xì)胞樣本進(jìn)行適當(dāng)洗滌、酶消化或EDTA處理，以清除雜質(zhì)，使粘附的細(xì)胞彼此分離而形成單細(xì)胞狀態(tài)；3.對(duì)新鮮實(shí)體瘤組織可選用或聯(lián)用酶消化法，機(jī)械打散法和化學(xué)分散法來獲得足夠數(shù)量的單細(xì)胞懸液；4.對(duì)石蠟包埋組織應(yīng)先切成若干40-50um厚的蠟片，經(jīng)二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細(xì)胞懸液；5.單細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)不應(yīng)少于10000個(gè)。
流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用：
1.其測定細(xì)胞內(nèi)DNA的變異系數(shù)小，一般在2%以下；
2.能準(zhǔn)確地進(jìn)行DNA倍體分析；
3.借助于熒光染料進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的定量研究；
4.快速進(jìn)行細(xì)胞分選和細(xì)胞收集；
5.醫(yī)學(xué)應(yīng)用：免疫功能研究各種干細(xì)胞的檢測，癌癥人的多藥耐藥性，細(xì)胞功能及代謝動(dòng)力學(xué)研究，血小板分析（心血管疾），流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究；
6 應(yīng)用于外周血內(nèi)皮細(xì)胞測定、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等*領(lǐng)域。
用于臨床編輯
流式細(xì)胞分析儀臨床用于細(xì)胞治療中心在FACSVantage 革命化的細(xì)胞分選功能基礎(chǔ)上推出的分選增強(qiáng)(SortEnhancededition,SE), BD FACSVantage SE,其新功能和新配置通過與標(biāo)準(zhǔn)多激光多熒光系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的*整合，速度更快，功能更強(qiáng)，是當(dāng)今流式技術(shù)的體現(xiàn)。

發(fā)展趨勢編輯
當(dāng)前，臨床流式細(xì)胞分析已成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個(gè)熱點(diǎn)，其發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。
一．從相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)到細(xì)胞計(jì)數(shù)
流式細(xì)胞分析大的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)混合細(xì)胞群體中亞群細(xì)胞的計(jì)數(shù)，如淋巴細(xì)胞可依其表面標(biāo)志的不同分為T淋巴細(xì)胞（CD3+）、B淋巴細(xì)胞（CD19+）、NK細(xì)胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細(xì)胞又可進(jìn)一步分為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4-CD8+）等。這些亞群細(xì)胞計(jì)數(shù)過去多以相對(duì)百分比表達(dá)結(jié)果，由于百分比只能代表每種細(xì)胞在混合細(xì)胞群體中所占的比例，并不能體現(xiàn)其在單位體積血液中的數(shù)量，而對(duì)艾滋等一些疾的臨床診斷，有時(shí)需要考慮細(xì)胞的數(shù)量，如患者血液中T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）的數(shù)量<200個(gè)/μL，而未發(fā)（僅有HIV感染）者的數(shù)量>200個(gè)/μL。T淋巴細(xì)胞亞群的計(jì)數(shù)在國外實(shí)驗(yàn)室早已成為常規(guī)檢查，但在國內(nèi)僅有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展?？梢灶A(yù)見，隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，對(duì)造血干細(xì)胞等的數(shù)量分析，不久的將來，也將作為常規(guī)檢查項(xiàng)目，走出實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床。
流式細(xì)胞計(jì)數(shù)在臨床可開展的項(xiàng)目包括：①淋巴細(xì)胞亞群，尤其是T淋巴細(xì)胞亞群的計(jì)數(shù)。②外周血或骨髓中造血干/祖細(xì)胞的計(jì)數(shù)。③血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)。④血液中血小板數(shù)量，尤其是血小板減少癥患者血小板的計(jì)數(shù)，此種計(jì)數(shù)優(yōu)于血細(xì)胞分析儀法，已成為血小板計(jì)數(shù)的推薦參考方法。此外，可能出現(xiàn)在血液中的其它一些稀少細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞等）的計(jì)數(shù)，也將發(fā)展為流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的開展對(duì)臨床疾的診斷、治療等有重要意義。
二．從相對(duì)定量到定量分析
細(xì)胞的多種成分如某些抗原或受體表達(dá)的流式細(xì)胞分析，以前多以平均熒光強(qiáng)度（MFI）或相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFI）表達(dá)其含量。由于流式細(xì)胞儀每次的儀器狀況可出現(xiàn)差異，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用儀器的類型也不盡相同，因此，以MFI或RFI表示細(xì)胞抗原或受體的表達(dá)量缺乏可比性，雖然流式細(xì)胞儀有*的熒光靈敏度，但卻無法準(zhǔn)確應(yīng)用這些信息。近年來，為了通過FCM精確定量分析細(xì)胞的某些成分，定量流式細(xì)胞術(shù)（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐漸得到發(fā)展，其定量分析原理主要有兩種：①定量抗體微球法：在特制的微球上包被已知分子數(shù)的羊抗鼠IgG分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子數(shù)的混合微球，此微球與待測標(biāo)本在相同條件下與熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）反應(yīng)后在流式細(xì)胞儀上測定其熒光強(qiáng)度，根據(jù)微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數(shù)和與之對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度計(jì)算回歸方程，再將待測樣本中陽性細(xì)胞的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度代入方程即可求得其每個(gè)細(xì)胞上的平均抗原分子數(shù)（抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)）。②定量熒光素分子微球法：在特制的微球上直接包被熒光素分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同數(shù)量熒光素分子的混合微球。在流式細(xì)胞儀儀器設(shè)置相同的條件下測定此微球及待測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，根據(jù)微球上所包被的熒光素分子數(shù)和與之對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度計(jì)算回歸方程，再將待測樣本陽性細(xì)胞的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度代入方程，可求得每個(gè)細(xì)胞上的平均熒光素分子數(shù)，根據(jù)用于樣本測定的單克隆抗體（McAb）與熒光素結(jié)合的分子比例，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞上的平均抗原分子數(shù)。單細(xì)胞的抗原或受體定量是流式細(xì)胞分析的重要進(jìn)展，為細(xì)胞的生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)等研究提供了更精確的方法。例如，白血原始細(xì)胞膜的CD45分子表達(dá)量低于正常淋巴細(xì)胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子數(shù)顯著高于靜止血小板，活化淋巴細(xì)胞的CD69分子數(shù)顯著增高，活化中性粒細(xì)胞膜CD64分子數(shù)顯著高于靜止中性粒細(xì)胞，強(qiáng)直性脊柱炎患者T淋巴細(xì)胞膜HLA-B27分子數(shù)明顯增高。CD8+T淋巴細(xì)胞膜的CD38分子數(shù)增高是慢性HIV感染者情發(fā)展或死亡的更有力的預(yù)后指標(biāo)；AIDS治療有效后，CD8+T淋巴細(xì)胞CD38分子數(shù)顯著降低。
三．從單色到多色熒光分析
流式細(xì)胞分析已從初的間接免疫熒光染色、單色或雙色直接熒光染色，迅速發(fā)展到三色、四色甚至五色或六色熒光分析，使得對(duì)細(xì)胞亞群的識(shí)別和分選、細(xì)胞功能評(píng)價(jià)等更為精確。目前，淋巴細(xì)胞亞群的分析、白血免疫表型分析，均應(yīng)使用至少三色以上的熒光分析才更可靠。例如：輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細(xì)胞白血的異常淋巴細(xì)胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+。多色熒光分析是流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的必然趨勢，有條件時(shí)應(yīng)盡可能地采用。
四．從細(xì)胞膜成份到細(xì)胞內(nèi)成份分析
細(xì)胞膜免疫表型分析是重要的流式分析內(nèi)容之一，很多細(xì)胞亞群的檢測和分選均是以細(xì)胞膜的免疫表型特征為依據(jù)，如T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分析、白血免疫分型等。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的，尤其對(duì)一些細(xì)胞的系列鑒定和功能狀態(tài)分析常常較為困難，而細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)成份的分析則更能反映某些細(xì)胞的系列特征和功能變化。隨著近年來細(xì)胞內(nèi)成分檢測技術(shù)的不斷完善，細(xì)胞內(nèi)成分檢測已成為流式細(xì)胞分析的又一個(gè)熱點(diǎn)。例如，急性髓系白血性原始細(xì)胞漿中檢測到髓過氧化物酶（MPO）是較為準(zhǔn)確的系列標(biāo)志，急性B淋巴細(xì)胞白血性原始細(xì)胞胞漿中檢測到CD79a是較為特異的系列標(biāo)志；檢測T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達(dá)，是判斷T淋巴細(xì)胞活化及其功能的重要手段，而且還能將輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（Th）進(jìn)一步分成Th1和Th2亞類，在Th1和Th2細(xì)胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通過細(xì)胞內(nèi)成分檢測技術(shù)與多色免疫熒光分析方法相結(jié)合，可檢測不同細(xì)胞亞群合成的不同細(xì)胞因子（Cytokine），如用五色疫熒光分析血液中淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑刺激后，輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞亞類—Th1細(xì)胞內(nèi)有細(xì)胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。
五．液體中可溶性成分的流式細(xì)胞分析
從傳統(tǒng)意義上講，流式細(xì)胞技術(shù)只能分析細(xì)胞及其成分，液體中的可溶性成分則不能進(jìn)行分析。然而，如果將液體中的可溶性成分結(jié)合在一種類似于細(xì)胞大小的顆粒（如乳膠顆粒）上，流式細(xì)胞儀便可以對(duì)其進(jìn)行分析，這就是近年來發(fā)展起來的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技術(shù)。CBA的原理是將包被某種抗原或抗體不同大小的微球與待測液體中的相應(yīng)成分反應(yīng)形成抗原與抗體的復(fù)合物，再加入熒光素標(biāo)記的第二抗體，微球上結(jié)合的待測抗原或抗體分子數(shù)量與其熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，由此可對(duì)待測液體中與微球上包被抗原或抗體分子相對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行定性或定量分析，例如同時(shí)測定血清或細(xì)胞培養(yǎng)液中的多種細(xì)胞因子，同時(shí)測定血清中多種自身抗體。CBA發(fā)展的時(shí)間雖很短，目前所能檢測的項(xiàng)目還不多，但其發(fā)展?jié)摿Σ蝗莺鲆?。已知檢測細(xì)胞因子的方法有多種，包括靶細(xì)胞功能分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、斑點(diǎn)酶免疫分析（Elispots）等，但CBA與之相比，其靈敏度*、可達(dá)2pg/ml，而且能同時(shí)測定單個(gè)標(biāo)本中的多種細(xì)胞因子。
六．分子表型分析
分子表型分析（Molecular Phenotyping）是指用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞中特異性核酸序列或特異性基因異常。流式分子表型分析與免疫表型分析技術(shù)相結(jié)合，為所選擇細(xì)胞亞群的特異性核酸序列（如癌基因、毒核酸等）檢測提供了一種非常有用的工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。流式分子表型與免疫表型分析結(jié)合的基本技術(shù)路線是：①待測細(xì)胞首先與特異性細(xì)胞亞群的單克隆抗體反應(yīng)，②固定并滲透細(xì)胞，③通過PCR進(jìn)行引物特異的核酸序列擴(kuò)增，④應(yīng)用對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性寡核苷酸熒光素標(biāo)記探針進(jìn)行熒光原位雜交（FISH），⑤加入針對(duì)細(xì)胞亞群單抗的熒光素標(biāo)記的第二抗體。⑥流式細(xì)胞儀檢測及數(shù)據(jù)分析。例如，流式細(xì)胞免疫表型與聚合酶鏈反應(yīng)及熒光原位雜交（PCR-FISH）結(jié)合測定血液CD4+細(xì)胞中HIV特異的DNA或RNA，對(duì)于AIDS的程監(jiān)測、治療反應(yīng)以及預(yù)后等具有重要價(jià)值。
流式熒光原位雜交（Flow-FISH）法可測定染色體端粒長度。細(xì)胞的染色體端粒是由2~20Kb串聯(lián)的短片段重復(fù)序列(TTAGGG)n和一些結(jié)合蛋白組成，端粒長度越長，所含重復(fù)堿基數(shù)目越多；用熒光素標(biāo)記的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特異性探針進(jìn)行FISH后，端粒的長短可以流式細(xì)胞儀檢測到的熒光強(qiáng)度的高低反映出來；Flow-FISH測定精度可小于3Kb的端粒長度差，對(duì)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、治療與預(yù)后等的研究有一定價(jià)值。