織切片上變性神經(jīng)元的胞體、樹突和軸突,而且能顯示腦內(nèi)

神經(jīng)細(xì)胞凋亡和組織中淀粉樣蛋白沉積。FJ染色除了能浸

染潰變神經(jīng)元外,還可以用于退變有髓纖維束的追蹤,如視

神經(jīng)束等。目前用于退變神經(jīng)元染色的FJ染料主要有FJ、FJB和FJC三種。與FJ和FJB染料相比[12],FJC染料效果更優(yōu),親和力更高,染色時間短,所需濃度低。此外,其還可

與其它熒光素標(biāo)記物結(jié)合進行多重?zé)晒馊旧?。Chidlow

等[13]采用FJC和DAPI(一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光

染料)熒光雙染技術(shù)評價大鼠視網(wǎng)膜和視神經(jīng)纖維損傷后

神經(jīng)元退變情況。Mechírová等[14]探討脊髓缺血/再灌注后

神經(jīng)元退變,試驗前預(yù)先施用去甲腎上腺素和銀杏葉乙醇提

取物EGb761的家兔,FJB染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注后大鼠

脊髓側(cè)角Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ對陽性神經(jīng)元明顯下降。

3 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色(Glial staining)

3.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞 Cajal法染色是一種選擇性浸染星形

膠質(zhì)細(xì)胞的染色技術(shù)。原理是切片經(jīng)氯化金汞溶液浸染,

然后通過亞硫酸鈉溶液使星形膠質(zhì)細(xì)胞著色穩(wěn)定。缺點是

染液需臨用前配制,不易保存,染色耗時長,染色結(jié)果不穩(wěn)

定。Kitch等[15]建立的星形膠質(zhì)細(xì)胞染色方法,能選擇性地

浸染原生質(zhì)型或纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體,而對其他膠質(zhì)

細(xì)胞的浸染具有抑制作用。但對于Ⅱ型阿爾采末病引起的

星形膠質(zhì)細(xì)胞病變狀態(tài)難以浸染。楊壯來在Cajal法染色的

基礎(chǔ)上對組織的切片,固定,浸染等步驟進行了修改。改良

后的方法使纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞染色均勻,背景淺,染色時

間明顯縮短。許多神經(jīng)退行性疾病,如帕金森病、阿爾采末

病,常與腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞,尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷(或退

化),腦中神經(jīng)纖維叢的出現(xiàn)以及類淀粉斑有關(guān)。鄧廣斐等

采用將神經(jīng)毒素MPTP注入C57BL/6小鼠腹腔建立帕金森

病動物模型。經(jīng)碳酸銀染色發(fā)現(xiàn),帕金森病模型組星形膠質(zhì)

細(xì)胞增生與激活明顯。

3.2 小膠質(zhì)細(xì)胞 1963年Naoumenko等報道采用碳酸銀

法浸染小膠質(zhì)細(xì)胞,再經(jīng)過甲醛溶液還原使銀沉積在組織切

片上。與常規(guī)HE染色相比,碳酸銀染色能夠顯現(xiàn)出胞體及

其突起。但碳酸銀見光易分解,不易保存。但后來Gallyas

報道的銀染法具有組織可于甲醛溶液中保存數(shù)年,適用于多

種標(biāo)本的取材,包括冰凍切片、石蠟切片等,可批量進行染色

操作,浸染過程可在鏡下操作便于控制染色時間等優(yōu)點。鄭

翔等將組織標(biāo)本由原來的火棉膠處理改為石蠟處理。雖然

準(zhǔn)確穩(wěn)定的浸染出小膠質(zhì)細(xì)胞,但仍存在一些缺陷,如切片

厚度不能太厚,背景過深等。于騰波等探討活化的小膠質(zhì)細(xì)

胞移植治療大鼠脊髓中度損傷的療效。碳酸銀染色和BBB

評分結(jié)果顯示:移植組比同期對照組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,

移植組術(shù)后后肢運動功能評分較對照組明顯升高。

3.3 少突膠質(zhì)細(xì)胞 少突膠質(zhì)細(xì)胞染色原理與其他鍍銀染

色技術(shù)相類似,主要依據(jù)神經(jīng)細(xì)胞嗜銀性。1930年P(guān)enfield

采用Del Rio?Hortega’s改良法成功浸染出少突膠質(zhì)細(xì)胞。

該法對脊髓,腦干及顱腦白質(zhì)區(qū)域的少突膠質(zhì)細(xì)胞浸染可靠

性好,并且還可選擇性浸染外周神經(jīng)施萬細(xì)胞的髓鞘,但染

色背景較粗糙,影響觀察。1948年Grino等將鎢酸鈉添加至硝酸銀溶液中,使少突膠質(zhì)細(xì)胞的呈現(xiàn)更為清楚。少突膠質(zhì)

細(xì)胞對氧具有特殊的親和力,經(jīng)過過氧化氫溶液處理后,激

活了少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的碳!基而發(fā)生顯色反應(yīng)。但此法對

于細(xì)胞突起的顯示不夠清晰,操作比較繁瑣。姚竹秀將Gri?no法進行改進,采用Peufield染色法所用的固定劑固定組織,得到較好的染色結(jié)果,并認(rèn)為固定劑成分和酸堿度對染

色的成敗大有關(guān)系。馬廷賢將銀溶液中的碳酸鈉濃度調(diào)至

飽和,用DAB和H2O2對切片進行預(yù)處理,同時把浸染的時間延長和溫度升高,染色結(jié)果穩(wěn)定性和成功率大為提高。細(xì)胞形態(tài)顯現(xiàn)的原因可能是DAB對銀離子具有吸附作用,使其在膠質(zhì)細(xì)胞的胞體和突起上沉積而顯色。

4 髓鞘染色(myelin staining)

髓鞘是包裹在神經(jīng)細(xì)胞軸突外面的一層膜。神經(jīng)纖維

受損時,如多發(fā)性硬化癥,腦脊髓炎等疾病均可導(dǎo)致髓鞘的

變形,崩解或脫失。目前常用髓鞘染色方法有媒染法,利用

鋨酸與類脂質(zhì)的特殊反應(yīng)和油溶性染料浸染法3種。媒染

法主要是因為經(jīng)鉻鹽或鐵礬媒染的磷脂(髓鞘主要成分)易

與蘇木素結(jié)合而著色,具有操作簡單,試劑便宜的優(yōu)點。但

染色結(jié)果對比度差、且分化不易掌控,較難被初學(xué)者所掌握。

鋨酸與類脂質(zhì)的特殊反應(yīng)主要原理是:將類脂質(zhì)組織(磷

脂)固定于鋨酸溶液后,能被氧化成黑色體,由此特異性鑒別

髓鞘。經(jīng)鋨酸固定后的類脂質(zhì)組織不會被脂溶性溶劑溶解,

提高了結(jié)果準(zhǔn)確性。但鋨酸價格昂貴,且不易久存;其次因

浸透性差,經(jīng)常造成組織背景模糊,不易觀察。油溶性染料

主要是指Luxol固藍,是Kluver等[16]于1953年將其應(yīng)用于

髓鞘染色。Luxol固藍在乙醇溶液內(nèi)具有與髓鞘磷脂結(jié)合染

色的特性,如再經(jīng)過中性紅或焦油紫復(fù)染,不僅對髓鞘著色

有一定的強化效應(yīng),而且還可浸染神經(jīng)元的胞核及尼氏體。Luxol固藍染色能夠浸染髓鞘束和單一髓鞘纖維,髓鞘著色鮮明,背景清晰。呂廣明認(rèn)為該法對于鑒定神經(jīng)髓鞘的特異性具有良好的標(biāo)記作用,常用于顯示髓鞘含量豐富的神經(jīng)傳導(dǎo)束,如皮質(zhì)脊髓束。此外,也可用來分析髓鞘再生及脫髓鞘的程度[17]。與媒染法、鋨酸染色法相比,對比度明顯提高,特異性好,但試劑較貴,不易購買。在研究神經(jīng)退行性疾病中,髓鞘染色通常與尼氏染色相結(jié)合,使結(jié)果對比鮮明。Chen等[18]探討3,4二羥苯基乳酸(DLA)對脊髓壓迫損傷后的炎癥影響。Luxol固藍和Nissl染色結(jié)果顯示,經(jīng)DLA 施用后的大鼠,傷后d10髓鞘退變緩慢。朱桂彬等利用改良的Marsland銀染法與Luxol固藍雙重染色觀察人老年癡呆癥尸檢腦組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦組織中老年斑呈均質(zhì)的嗜銀團,神經(jīng)元纖維增粗,扭曲形成纏結(jié)清晰可見,且染色背景清晰,幾無銀顆粒沉淀。

5 突觸染色(synapse staining)

目前有兩種顯示神經(jīng)突觸的方法。鍍銀染色法通常采

用Cajal染色法和Golgi染色法來顯示突觸,其主要根據(jù)突觸

的嗜銀性而使突觸著色[19]。但由于過程繁瑣,染色結(jié)果不

穩(wěn)定而未被廣泛使用。Singh[20]通過改良鍍銀染色發(fā)現(xiàn),大

鼠傷后d7即可在神經(jīng)纖維網(wǎng)齒狀回觀察到少量退變突觸。

楊壯來將Cajal法進行改良并成功顯示神經(jīng)突觸。改良后的