堿性磷酸酶（ALP）是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶之一。1 Gomori鈣鈷法
【染色原理】 ALP在pH值9.4的環(huán)境下，以鎂離子作為激活劑，能夠把β-*水解出磷酸，磷酸與高濃度的鈣鹽結(jié)合形成無色的磷酸鈣，再與硝酸鈷作用形成磷酸鈷，經(jīng)硫化胺處理形成黑色的硫化鈷沉淀在酶活性處。
【孵育液配制】3%β-* 5ml
2%*鈉 5ml
蒸餾水 10ml
2% CaCl2 10ml
2% MgSO4 1ml
【步驟】
（1）將無菌的玻片放入培養(yǎng)皿中，傳代時(shí)加入適量的細(xì)胞懸液，作細(xì)胞爬片，呆細(xì)胞長滿玻片后取出。
（2）PBS沖洗后用冷丙醇固定10min，蒸餾水沖洗數(shù)次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自來水沖洗數(shù)次。
（4）2%硝酸鈷中浸3-5min，蒸餾水洗數(shù)次。
（5）1%的硫化銨中2min，自來水沖洗，自然干燥，封固。
【結(jié)果】胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀。
2 偶氮偶聯(lián)法：
【孵育液配制】 萘酚AS-BI磷酸鹽 20mg
DMSO 0.5ml
0.2mol/L*醋酸緩沖液（PH 9.2） 50ml
六偶氮副品紅 0.5ml
1mol/L NaOH調(diào)PH 9-10，混合后過濾使用。
（六偶氮副品紅：副品紅400mg，濃鹽酸2ml，雙蒸水8ml混合過濾；臨用前與等體積4%*混合）
【步驟】
（1）細(xì)胞爬片成功后，PBS沖洗后，置入4℃ 10%甲醛固定10min。
（2）蒸餾水沖洗。
（3）將過濾孵液直接滴加于玻片上，室溫下作用45min。
（4）流水沖洗，晾干。
（5）甘油明膠封固。
【結(jié)果】成骨細(xì)胞胞質(zhì)中可見紅色ALP陽性顆粒。
3 堿性磷酸酶染色試劑盒法：
【作用原理】 細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶在Ph9.4-9.6條件下水解磷酸萘酚AS-MX產(chǎn)生萘酚，后者被重氮鹽捕獲，生成不溶性有色沉淀。
【作用液配制】取2號儲備液10ml，加3號液200ul，再加4號粉劑10mg，振搖速溶，立即過濾到細(xì)胞爬片上。
【步驟】
（1）細(xì)胞爬片滴加數(shù)滴1號液，室溫固定一分鐘（不可以延長），流水漂洗2分，晾干。
（2）滴加作用液數(shù)滴，置濕盒內(nèi)于37℃孵育2小時(shí)，流水沖洗2分鐘。
（3）滴加5號液數(shù)滴，復(fù)染5分鐘，流水沖洗2分鐘，晾干。
【結(jié)果】陽性結(jié)果是胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色沉淀。
1 茜素紅法
【步驟】
（1）培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10min，雙蒸水沖洗3次。
（2）0.1%茜素紅-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。
（3）蒸餾水沖洗，干燥，封片。
【結(jié)果】染料品種的不同，礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)不同的紅色。
2 von Kossa法
【步驟】
（1）培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，4％多聚甲醛固定5分鐘，雙蒸水沖洗3次。
（2）培養(yǎng)皿中加入5％*溶液1ml，將培養(yǎng)板開蓋在紫外燈下照射1小時(shí)。
（3）倒出殘留的*溶液，蒸餾水沖洗3遍。
（4）培養(yǎng)皿中加入5％*溶液1ml，中和殘留的*溶液，吸出殘液。
（5）室溫下晾干，封固。