激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscope）是20世紀80年代中期發(fā)展起來并得到廣泛應用的新技術(shù) [1]  ，它是激光、電子像和計算機圖像處理等現(xiàn)代高科技手段滲透，并與傳統(tǒng)的光學顯微鏡結(jié)合產(chǎn)生的的細胞分子生物學分析儀器，在生物及醫(yī)學等領(lǐng)域的應用越來越廣泛，已經(jīng)成為生物醫(yī)學實驗研究的*工具 [2]  。
傳統(tǒng)熒光顯微鏡使用熒光物質(zhì)標志細胞中的特定結(jié)構(gòu)，不僅圖像與背景的對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辨率(δ=0.61·λ/NA，其中δ為顯微鏡的分辨率；λ為照明光線的波長；NA 為物鏡的數(shù)值孔徑)。但當所觀察的熒光標本稍厚時，傳統(tǒng)熒光顯微鏡一個難以克服的缺點就顯現(xiàn)出來：焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛。原因是大多數(shù)生物學標本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)(如耳蝸基底膜。其實是外毛細胞 、多種支持細胞 、神經(jīng)纖維等組成的空間結(jié)構(gòu)),，在普通光學顯微鏡下聚焦平面的變化， 會表現(xiàn)出不同的形態(tài)。假若熒光標記的結(jié)構(gòu)在不同層次上都有分布，且重疊在一起，反射熒光顯微鏡(epifluorescent microscope)不僅從焦平面上收集光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡所接收，熒光顯微鏡的光學分辨率就要大大降低 。
在傳統(tǒng)光學顯微鏡基礎(chǔ)上，激光掃描共聚焦顯微鏡用激光作為光源，采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計算機對所觀察的對象進行數(shù)字圖像處理觀察、分析和輸出。 其特點是可以對樣品進行斷層掃描和成像，進行無損傷觀察和分析細胞的三維空間結(jié)構(gòu)[3]。 同時，利用免疫熒光標記和離子熒光標記探針，該技術(shù)不僅可觀察固定的細胞、組織切片,還可以對活細胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子及生命活動進行實時動態(tài)觀察和檢測，在亞細胞水平上觀察諸如 Ca2+，pH 值，膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學、分子細胞生物學、神經(jīng)科學、藥理學、遺傳學等領(lǐng)域中新一代強有力的研究工具 [3]  ，極大地豐富了人們對細胞生命現(xiàn)象的認識。
激光共聚焦顯微鏡結(jié)構(gòu)編輯
激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作掃描光源，逐點、逐行、
逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。
在結(jié)構(gòu) [4]  配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學顯微鏡的基本構(gòu)造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統(tǒng) (包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應用軟件)、圖像輸出設(shè)備、光學裝置和共聚焦系統(tǒng)等部分 [2]。由于該儀器具有高分辨率、高靈敏度、“光學切片”（Optical sectioning）、三維重建、動態(tài)分析等優(yōu)點，因而為基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床醫(yī)學的研究提供了有效手段。此外，CLSM 對熒光樣品的觀察具有明顯的優(yōu)勢，只要能用熒光探針進行標記的樣品就可用其觀察。
激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量, 配合焦點穩(wěn)定系統(tǒng)可以實現(xiàn)長時間活細胞動態(tài)觀察。
激光共聚焦顯微鏡原理編輯
在普通寬視野光學顯微鏡中，整個標本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察 [5]  。 同時，來自焦點以外的其他區(qū)域的熒光對結(jié)構(gòu)的干擾較大，尤其是標本的厚度在 2um 以上時，其影響更為明顯。
激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，
圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡光路圖
圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡光路圖
采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。 組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管（PMT）探測收集，并將信號輸送到計算機，處理后在計算機顯示器上顯示圖像 [6]  。 在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區(qū)域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦[7]。 以激光作光源并對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。
應用編輯
應用功能
激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM)是近代的細胞生物醫(yī)學分析儀器之一。它是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激光熒光探針，利用計算機進行圖像處理，不僅可觀察固定的細胞、組織切片，還可對活細胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進行實時動態(tài)地觀察和檢測。目前，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)已用于細胞形態(tài)定位、立體結(jié)構(gòu)重組、動態(tài)變化過程等研究，并提供定量熒光測定、定量圖像分析等實用研究手段，結(jié)合其他相關(guān)生物技術(shù)，在形態(tài)學、生理學、免疫學、遺傳學等分子細胞生物學領(lǐng)域 [7]  得到廣泛應用。
組織和細胞中的定量熒光測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可以從固定和熒光染色的標本以單波長、雙波長或多波長模式，對單標記或多標記的細胞及組織標本的共聚焦熒光進行數(shù)據(jù)采集和定量分析,同時還可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加， 形成組織或細胞中熒光標記結(jié)構(gòu)的總體圖像,以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。 常用于原位分子雜交、腫瘤細胞凋亡觀察、單個活細胞水平的 DNA 損傷及修復等定量分析。
細胞間通訊的研究
動物和植物細胞中縫隙連接介導的胞間通信在細胞增殖和分化中起著重要作用。 激光掃描共聚焦顯微鏡可通過觀察細胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移來測量傳遞細胞調(diào)控信息的一些離子、小分子物質(zhì)。 該技術(shù)可以用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機制和作用，也可用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學物質(zhì)。
細胞物理化學測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可對細胞形狀、周長、面積、平均熒光強度及細胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進行自動測定。 能對細胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進行定量、定性、定時及定位測定。
細胞內(nèi)鈣離子和 pH 值動態(tài)分析
激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)是測量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對焦點信息的有效辨別使在亞細胞水平顯示離子分布成為可能。 利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可以測量單個細胞內(nèi) pH 和多種離子(Ca2+、K+、Na+、Mg2+)在活細胞內(nèi)的濃度及變化。 一般來說，電生理記錄裝置加像技術(shù)檢測細胞內(nèi)離子量變化的速度相對較快,但其圖像本身的價值較低,而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結(jié)構(gòu)中鈣離子濃度動態(tài)變化的圖像,這對于研究鈣等離子細胞內(nèi)動力學有意義。
三維圖像的重建
傳統(tǒng)的顯微鏡只能形成二維圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡通過對同一樣品不同層面的實時掃描成像，進行圖像疊加可構(gòu)成樣品的三維結(jié)構(gòu)圖像。 它的優(yōu)點是可以對樣品的立體結(jié)構(gòu)分析，能十分靈活、直觀地進行形態(tài)學觀察,并揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。
熒光漂白恢復技術(shù)
該方法的原理是一個細胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力，而鄰近未被漂白細胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴散到已被漂白的細胞中，熒光可逐漸恢復。 可通過觀察已發(fā)生熒光漂白細胞其熒光恢復過程的變化量來分析細胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。
長時程觀察細胞遷移和生長
活細胞觀察通常需要一定的加熱裝置及灌注室，以保持培養(yǎng)液的適宜溫度及 CO2 濃度的恒定。 目前的激光掃描共聚焦顯微鏡，其光子產(chǎn)生效率已大大改善，與更亮的物鏡和更小光毒性的染料結(jié)合后可以減小每次掃描時激光束對細胞的損傷,用于數(shù)小時的長時程定時掃描,記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現(xiàn)象。
應用領(lǐng)域
在細胞及分子生物學基礎(chǔ)研究中的應用
激光掃描共聚焦顯微鏡應用照明針與檢測孔共軛成像，有效抑制了焦外模糊成像并可對標本各層分別成像，對活細胞行無損傷的“光學切片”這種功能也被形象的稱為“顯微 CT”。CLSM 還可以對貼壁的單個細胞或細胞群的胞內(nèi)、胞外熒光作定位、定性、定量及實時分析，并對胞內(nèi)成分如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、DNA、RNA、Ca2+、Mg2+、Na+ 等的分布、含量等進行測定及動態(tài)觀察，使細胞結(jié)構(gòu)和功能方面的研究達到分子水平。
在腫瘤和抗癌藥物篩選研究中的應用
普通顯微鏡及電子顯微鏡，僅能對腫瘤相關(guān)抗原進行定性分析，而 CLSM 則可對單標記或者多標記細胞、組織標本及活細胞進行重復性的熒光定量分析，從而對腫瘤細胞的抗原表達、細胞結(jié)構(gòu)特征，抗腫瘤藥物的作用及機制等方面定量化 [8-9]  。
在血液病學和醫(yī)學免疫學研究中的應用
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察免疫細胞和系統(tǒng)，如樹突狀細胞、單核-吞噬細胞系統(tǒng)、自然殺傷細胞、淋巴細胞時，在準確細胞定位的同時有效鑒定免疫細胞的性質(zhì)。
在大腦和神經(jīng)科學中的應用
激光掃描共聚焦顯微鏡分層掃描發(fā)現(xiàn)神經(jīng)軸突的內(nèi)部結(jié)構(gòu)連續(xù)性好。用激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察到腦干組織中神經(jīng)軸突的正常走向，可排除在熒光顯微鏡下由此造成的一些病理假象 [10]  。并且激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察神經(jīng)軸突的三維結(jié)構(gòu)，因此應用 CLSM 有可能觀察到普通光鏡下未能發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)組織的細微病變[11]。
在眼科研究中的應用
利用激光掃描共聚焦顯微鏡可以觀察晶狀體，角膜、視網(wǎng)膜、虹膜和睫狀體的結(jié)構(gòu)和病理變化[12]。
在骨科研究領(lǐng)域中的應用
激光掃描共聚焦顯微鏡在骨科研究領(lǐng)域的應用現(xiàn)狀表明，CLSM在觀測骨細胞形態(tài)學研究、骨細胞特異性蛋白（骨鈣素）以及骨細胞之間的相互作用具有顯著的優(yōu)勢。
結(jié)語編輯
激光掃描共聚焦顯微鏡作為一項全新的實驗手段和強有力的研究工具，為我們解決一些以往研究工作中不能解決的技術(shù)難題創(chuàng)造了條件，因而必將得到更為廣泛的應用。隨著新軟件的不斷開發(fā)及各個學科 [11-12]  的不斷發(fā)展和相互滲透，相信它還將會有更廣闊的發(fā)展前景。