*12測(cè)定培養(yǎng)基原理
乳酸桿菌生長(zhǎng)需要特別的營(yíng)養(yǎng)，因而在非選擇性培養(yǎng)基上很難生長(zhǎng)。維生素測(cè)定用培養(yǎng)基用于維生素的微生物法測(cè)定。該方法需要三種培養(yǎng)基：即維持培養(yǎng)基，用于保持菌種活力；接種培養(yǎng)基，用于測(cè)試菌液的制備；測(cè)定用培養(yǎng)基，用于待測(cè)維生素的定量。
*12測(cè)定用培養(yǎng)基，不含*12，但包含所有其他維生素和必要養(yǎng)分，用于萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）的生長(zhǎng)。萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測(cè)定用菌，zui早由Capp等人描述（1）并被美國(guó)藥典和美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）所*（2，3）。
用已知稀釋度的*12標(biāo)準(zhǔn)品，可以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（2，3）。
測(cè)試菌液的制備是將將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，*在37°C 孵育24 小時(shí)，再離心、清洗、重懸于10 ml 生理鹽水中，再通過(guò)濁度分析或酸度分析，確定生長(zhǎng)反應(yīng)。
用*12的濃度及對(duì)應(yīng)的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用標(biāo)準(zhǔn)曲線可確定待測(cè)樣本中的*12的濃度。
應(yīng)非常小心地避免培養(yǎng)基和玻璃器具的污染。應(yīng)使用潔凈的無(wú)去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
用于接種的測(cè)定菌應(yīng)在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
*12測(cè)定培養(yǎng)基應(yīng)用
*12測(cè)定用培養(yǎng)基*采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測(cè)定用菌，進(jìn)行*12的微生物法測(cè)定。
培養(yǎng)基組分
成分 克/升
無(wú)維生素酸水解酪蛋白 15.000
葡萄糖 40.000
天* 0.200
醋酸鈉 20.000
抗壞血酸 4.000
L-* 0.400
DL-* 0.400
硫酸腺嘌呤 0.020
* 0.020
黃嘌呤 0.020
核黃素（*2） 0.001
鹽酸硫胺素 0.001
* 0.00001
* 0.002
對(duì)氨基苯甲酸（PABA） 0.002
* 0.001
鹽酸吡哆醇 0.004
鹽酸吡哆醛 0.004
* 0.0008
* 0.0002
磷酸二氫鉀 1.000
* 1.000
* 0.400
氯化鈉 0.020
* 0.020
硫酸錳 0.020
聚山梨酯80 2.000
鹽酸* 0.020
zui終pH值 (25°C) 6.1±0.2
質(zhì)量控制
Ø外觀——奶油色至黃色，具均勻性，傾向形成可容易分解成粉末狀的軟塊
Ø制備好的培養(yǎng)基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有輕微沉淀
Ø配比濃度——在25°C下8.5%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值為6.1±0.2
ØpH值——5.90-6.30
配置
稱取8.45g干粉培養(yǎng)基溶于100ml蒸餾水，必要時(shí)加熱使培養(yǎng)基*溶解。混勻，使輕微的沉淀均勻分布。測(cè)定時(shí)，分裝試管，每管為5ml培養(yǎng)基（包含標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品）。加蒸餾水，使總體積達(dá)到10ml。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻培養(yǎng)基。每個(gè)試管(10 ml)的*12水平為0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2 ng時(shí)，均可獲得滿意結(jié)果。
培養(yǎng)反應(yīng)
進(jìn)行微生物法測(cè)定*12。采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830），35-37°C孵育18-24小時(shí)。
生長(zhǎng)狀況
隨著測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)品水平升高，（美國(guó)藥典*12標(biāo)準(zhǔn)水平，0，0.025,0.050，0.075,0.1,0.125,0.150,0.2ng)，目標(biāo)菌生長(zhǎng)逐漸遞增，伴隨著620nm處吸光度的增加。
