CFDA, SE 細(xì)胞增殖示蹤熒光探針運(yùn)輸與保存方法
熒光標(biāo)記細(xì)胞已被廣泛證實(shí)可有效確定總細(xì)胞的數(shù)量和一個(gè)樣本中存在多少活細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光染色法是分析非均質(zhì)細(xì)胞種群的有力工具。非熒光性的FDA和它的衍生物分子進(jìn)入細(xì)胞后被胞內(nèi)無特異性的酯酶所水解產(chǎn)生熒光。這些熒光產(chǎn)物只能積聚在具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞中。因此，死細(xì)胞無完整細(xì)胞膜不能被染色。FDA及其類似物（如CDCFDA）精細(xì)的跨膜動(dòng)力學(xué)以及胞內(nèi)水解特點(diǎn)與細(xì)胞功能相關(guān)，因此FDA標(biāo)記可以通過熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀來檢測細(xì)胞。然而，因?yàn)镃FSE和它的熒光類似物與GFP或者FITC具有相同的激發(fā)光譜，因此CFSE和它的熒光類似物不能用于GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者FITC標(biāo)記抗體的應(yīng)用中。VFSE染料與CFSE功能相似，因?yàn)樗鼈兌及ッ盖懈詈桶贩磻?yīng)的SE基團(tuán)。VFSE染料能用于多色反應(yīng)，因?yàn)閂FSE與CFSE和它的熒光類似物具有不一樣的激發(fā)和發(fā)射光譜， 因此可以用于GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者FITC標(biāo)記抗體的應(yīng)用中。
常用名 | CDCFDA | ||
中文名稱 | 活細(xì)胞熒光示蹤探針 | ||
英文名稱 | 5-(and-6)-Carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate, succinimidyl ester | ||
CAS# | / | 分子式 | C29H19 |
分子量 | 626.35 | 純度 | ≥95%（HPLC） |
Ex(nm) | 504 | Em(nm) | 529 |
結(jié)構(gòu)式 |
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CFDA, SE 細(xì)胞增殖示蹤熒光探針運(yùn)輸與保存方法
常溫運(yùn)輸，-20℃干燥避光保存，保質(zhì)期24個(gè)月。避免反復(fù)多次凍融。
使用方法
1.保存液配制（5mM）
按需配制，如取DMSO 360μL，溶解1mg CDCFDA，超音波溶解，得到5mM 保存液；將其按40μL體積分裝于避光的無菌凍存管中，-20℃可保存2個(gè)月。
注意：CDCFDA遇水容易分解，所以在配置時(shí)候要用無水DMSO，配置后計(jì)算用量盡快使用，多余的立刻避光保存-20℃。DMSO是有機(jī)溶劑，對于蛋白質(zhì)會有損傷，所以在配置的時(shí)候DMSO用量越少越好；
2. 工作液配制
取5mM的CDCFDA稀釋液1 ul，加入1ml 10％FCS 的PBS稀釋。
3.染色
a.重懸細(xì)胞。用有5％FCS的PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度一般為1x1x106/ml （體外實(shí)驗(yàn)）或1x1x107/ml（轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)）。
b.染色。1ml DFSE工作液與1ml細(xì)胞懸液混合后37℃孵育5－10分鐘。期間輕輕混勻兩次（用手輕彈管壁，切忌吹打）。
c.終止染色。用*培養(yǎng)液洗滌3次并離心。一般在第2次洗滌后再孵育5分鐘后進(jìn)行第3次洗滌。冰冷的含10 %新生牛血清RPMI1640（先加入1ml混勻 ，然后續(xù)加入7ml）, 輕輕混勻1min（用手輕彈，切忌吹打）,1 500 r/ min 離心5 min。
d.流式細(xì)胞儀在FL1通道檢測。
