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免疫印跡Western Blot實驗代測
免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA 結合蛋白和其相關的DNA 結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術zui初用于研究DNA 結合蛋白，目前已用于研究RNA 結合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
| Western blot 檢測 | 1400元/膜 | 每張膜1--8樣本 |
| EMSA | 2800元/膜 | 每張膜1--8樣本，包括探針及試劑 |
上海信帆代做實驗項目:ELISA,免疫組化,免疫印跡Western Blot,放射免疫,實時熒光定量ＰＣＲ,，免疫組織，特殊染色,病理學檢測技術服務等等!我們擁有的實驗室,客戶檢測項目均提供實驗室儀器型號,提供操作詳細步驟.歡迎!
Western Blot實驗
成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：
凝膠洗脫：轉移期間蛋白質必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質還截留在凝膠中，將無法在膜上進行分析
吸附到膜上：在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進行分析
處理期間仍截留在膜上：在轉移后的處理過程中蛋白質必須保持吸附在印跡膜上
處理過程中可接近：被吸附的蛋白質必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質被掩蓋則無法檢測
成功進行WB檢測，則設置合適正確的對照是*的，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到WB的問題所在，并保證實驗結果的準確性和特異性！一般需要設置的對照如下：
陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率
陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用于檢測抗體的特異性
二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性
內參對照：檢測標本的質量和二抗系統(tǒng)
空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質和封閉的效果
WB 檢測基本過程
1 、獲取細胞或組織裂解物
1)根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
| 蛋白位置 | buffer |
| 全細胞 | NP-40 or RIPA |
| 胞漿（可溶性蛋白） | Tris-HCl |
| 胞漿（骨架結合蛋白） | Tris-Triton |
| 膜蛋白 | NP-40 or RIPA |
| 核蛋白 | RIPA or 核蛋白提取試劑盒 |
| 線粒體蛋白 | RIPA or 線粒體分離試劑盒 |
亦可購買商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來保證標本制備的質量
2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性！
2 、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據情況將標本保存在-20°C /-80°C備用，進行免疫沉淀（IP）或者直接進行電泳分離蛋白
3 、電泳分離蛋白質
根據待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件：
| 待測蛋白狀態(tài) | 凝膠條件 | 上樣buffer | 電泳buffer |
| Reduced - Denatured | 還原，變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Reduced - Native | 還原，不變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| Oxidized - Denatured | 不還原，變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Oxidized - Native | 不還原，不變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
根據待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
| 蛋白分子量（kDa） | 凝膠濃度（％） |
| 4-40 | 20 |
| 12-45 | 15 |
| 10-70 | 12.5 |
| 15-100 | 10 |
| 25-200 | 8 |
4 、轉膜
根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術參數及比較如下：
| | PVDF膜 | NC膜 | 尼龍膜 |
| 靈敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
| 背景 | 低 | 低 | 較高 |
| 蛋白結合能力 | 100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
| 機械強度 | 強 | 干的膜易脆 | 軟而結實 |
| 溶劑抗性 | 強 | 差 | 差 |
| 使用前是否需要浸潤 | 100%甲醛潤濕 | 緩沖液潤濕 | 緩沖液潤濕 |
| 適用染色方法 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用陰離子染料 |
| 適用檢測方法 | 顯色法、化學發(fā)光、熒光、放射性、化學熒光、快速免疫檢測 | 顯色法、化學發(fā)光、熒光、放射性 | 顯色、化學發(fā)光、放射性 |
| 適用范圍 | 普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質測序、氨基酸分析、重復檢測 | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重復檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白 | 低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用 |
| 價格 | 高 | 較低 | 低 |
5 、封閉
去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6 、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：
選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）
選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）
選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體
免疫印跡Western Blot實驗代測
一抗的保存和使用：
根據說明書的要求條件進行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復凍融。
抗體的工作液現配現用，在4度保存不要超過2周
根據說明書濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書的稀釋比例只作參考，需要在說明書的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索稀釋度（1:100-1:3000）。
孵育條件：4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據抗體親和力不同孵育時間有所區(qū)別
內參的選擇和使用：WB 過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標準！
WB常用內參及其技術參數：
| 內參名稱 | 分子量大小 | 適用范圍 |
| beta-actin | 43kDa | 胞漿和全細胞 |
| GAPDH | 30-40kDa | 胞漿和全細胞 |
| Tubulin | 55kDa | 胞漿和全細胞 |
| VCDA1/Porin | 31kDa | 線粒體 |
| COXIV | 16kDa | 線粒體 |
| TBP | 38kDa | 細胞核 |
詳情請參考
7 、二抗孵育
根據說明書濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時
8 、底物孵育
選擇顯色或者化學發(fā)光底物。一般傾向于化學發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量
9 、結果分析和檢測
凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片
注意事項
1、 抗體：事先咨詢信帆生物，明確抗體種屬及指標名稱，確定我司抗體庫否有該抗體可使用，如有一抗可免費提供，如無可由雙方協商而定，客戶自己購買提供或我公司代購；
2、 標本收集與保存：
組織樣品 新鮮組織放入液氮或-70度保存，組織不少于100mg（約綠豆大?。?
培養(yǎng)細胞 通過細胞計數取不少于100萬個細胞于EP管，加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，混勻后保存于冰箱（-70℃，避免反復凍融）；
血液細胞標本 以抗凝管保存血樣或以淋巴細胞分離液分離細胞后加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，保存（-70℃可保存，避免反復凍融）
血清或細胞培養(yǎng)液標本 離心去掉雜質后取上清入EP管，保存（以上4℃可保存15-20天，-70℃可保存，避免反復凍融）
3 、 樣本運輸：可選以下任何的一種方式寄送標本
組織樣本、細胞樣本以干冰運輸或加入蛋白保護劑后加冰袋運輸；
細胞樣本也可以直接快件寄送培養(yǎng)瓶（密封保證不污染，培養(yǎng)液不漏出，細胞不要長得太滿，50%左右，灌滿培養(yǎng)液）；
血清或上清液直接加冰袋寄送（密封保證液體不漏出，視路途遠近2-3天可到達）。
流程：
1、客戶告知實驗分組、編號、檢測樣本類型、種屬、指標，有具體要求請事先說明；
2、簽訂合同，寄送樣本和抗體，如需我方提供抗體請事先說明；
3、客戶支付預付款，進行實驗。
4、提供原始數據，分析數據，實驗室儀器型號，所用試劑品牌貨號，圖片，實驗報告等！
